МПВИ птиц

Репродукция метапневмовируса в клеточных культурах.

Способность вирусов, наряду с репликацией инициировать цитопатогенное действие в чувствительных клетках является их генетическим маркером. Первичное выделение метапневмовирусов (МПВ) птиц проводили в культуре фибробластов куриных эмбрионов с последующей адаптацией в клетках Vero и QT. Вирус индуцировал характерные синцитии. Аттенуированные вакцины против метапневмовирусной инфекции, вызванной МПВ птиц подгруппы C, были получены в клеточных культурах. Возможность культивирования вакцинных штаммов P 63-APV и ca-APV в различных перевиваемых линиях клеток (Vero, BGM, MA-104, BНK-21, McCoy, DF-1, QT-35, TEF) сообщали Patnayak et al. (2005). А.Б. Сарбасов с соавт. (2003); И. А. Борисова (2008) культивировали МПВ птиц для наработки вирусной биомассы в клетках Vero при изготовлении инактивированной вакцины против метапневмовирусной инфекции птиц. Вирус накапливался в титрах 6.0-6.5lg ТЦД 50/см³. Антигены для ELISA могут быть приготовлены на различных системах, включающих ФЭК или клетки Vero. Очевидно, что получение высокоактивного антигена метапневмовируса для иммуноферментного анализа зависит от выбора биологической модели для его культивирования.

Цель и задачи иследований

Целью наших исследований явилось изучение процессов репликации вакцинных штаммов метапневмовируса птиц в различных клеточных системах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: Изучить процесс репликации вируса в первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов. Изучить процесс репликации вируса в клетках Vero.

Материалы и методы

Вирус. В работе использовали эталонные производственные вакцинные штаммы 8544 подтипа А и VC-03 подтипа В, реизолированные из лиофилизированных препаратов производства фирм Intervet и Rhone Merilux. Культуры клеток:

  • Первично-трипсинизированная культура клеток куриных эмбрионов (ФЭК);
  • Перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки (клетки Vero), институт гриппа, Санкт-Петербург.
  • Инкубационные яйца СПФ-кур фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия).
  • Питательные среды, сыворотки и растворы:
  • Питательная среда Игла МЕМ или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином;
  • Питательная среда № 199, жидкая, с L-глутамином;
  • Питательная среда ДМЕМ/F12 с Hepes, жидкая;
  • Сыворотка крови крупного рогатого скота, не консервированная для культур клеток (КРС);
  • Сыворотка крови плодов коровы;
  • Трипсина раствор 0,25% фирмы «US BIO»;
  • Версена раствор 0,02%;
  • Хенкса раствор фирмы «Hyclone».
  • Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone», производство ООО «Биолот»;

Первично-трипсинизированную культуру клеток (ФЭК) готовили по методу Dulbecco a. Vogt (1954) в модификации Youngner (1954). Культуру выращивали в стационарных условиях в течение 2-3 суток до формирования ровного плотного монослоя в ростовой среде Игла МЕМ и №199 в соотношении 2:1 с содержанием до 10% сыворотки крови КРС, а клетки Vero – в среде ДМЕМ/F12 и 10% сыворотки крови плодов коровы. Перед заражением пробирочные культуры клеток освобождали от ростовой среды, отмывали поддерживающей средой, вносили вируссодержащий материал в дозе 0,1-1,0 ЦПД50 на клетку и оставляли культуру при (37,5±0,5)°C в течение 30-60 минут для адсорбции вируса. Затем добавляли поддерживающую среду без сыворотки крови. Инфицированные культуры инкубировали в течение 4-6 суток при температуре 37,5°C до появления выраженного цитопатогенного действия вируса. Вируссодержащую суспензию замораживали, оттаивали и объединяли в общую пробу. Инфекционную активность штаммов вируса определяли в культуре клеток по Reed a. Muench (1938). Специфичность действия вируса на клетки подтверждали в реакции нейтрализации (3. Лярски, 1980).

Результаты исследований

При микроскопическом изучении неокрашенных клеточных культур, зараженных вакцинными штаммами МПВП, отмечали характерные цитопатические изменения, которые выражались в дегенерациях клеток через различные сроки после инокуляции. Использованные штаммы вируса адаптировались к условиям культивирования в культурах клеток ФЭК и клетках Vero с первого пассажа. Вакцинные штаммы вируса вызывали фокусные изменения клеточного монослоя в виде округления клеток и появления в них зернистости через 48-72 ч. после инфицированния клеток Vero и ФЭК. В процессе инкубации интенсивность цитопатогеннного действия вируса на клетки повышалась. Цитопатические изменения были характерны для острой формы инфекции и выражались в дегенеративных изменениях в клетках, образовании синцитий и гибели клеток монослоя. Данные определения инфекционного титра штаммов в процессе 10 пассажей представлены в таблице. В результате проведенных исследований установлено, что метапневмовирус накапливался в высоких титрах в перевиваемой линии клеток Vero и ниже в первично-трипсинизированной культуре ФЭК, причем в более высоких титрах накапливался штамм VC-03, чем штамм 8544. Чувствительность клеточных культур к вакцинному штамму VC-03 МПВ птиц была выше, по сравнению со штаммом 8544. Полученные нами результаты исследования подтверждают данные ряда ученых установивших, что чувствительными клеточными культурами к МПВ птиц являются первично-трипсинизированная культура ФЭК и перевиваемая линия клеток Vero.

Выводы и рекомендации

Вакцинные штаммы 8544 и VC-03 МПВ птиц вызывают острую форму инфекции в испытуемых клеточных культурах, обуславливая дегенерацию и гибель клеток, образование синцитий. Установлены различия штаммов вируса в биологической активности в зависимости от вида культуры клеток. Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что для наработки вируссодержащего материала МПВ птиц для ИФА можно использовать обе биологические системы, но предпочтительнее использовать перевиваемую линию клеток Vero.

Список литературы

  1. Борисова И.А. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против Ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц //Борисова И.А./ Автореф. дис.канд.биол.наук. - Владимир.-2008-25 С.
  2. Сарбасов А.Б. Изучение антигенных свойств пневмовируса птиц на цыплятах //Сарбасов А.Б., Старсов С.К., Борисов А.В. [и др.]/ Актуал. пробл. информ. патологии животных - Владимир-2003.-с.354-356.
  3. Лярски З. Диагностика вирусных болезней животных //Лярски З./ Под редакцией В.Н. Сюрина. – М.: Колос, 1980.-400С.
  4. Никитина Н.В. Получение антигена пневмовируса птиц для иммуноферментного анализа //Н.В.Никитина, Б.Б.Трефилов, Д.В.Дмитриев[и др.]/ Новое в диагностике и профилактике болезней птиц (матер. научно-практ.конф. 3-4 июня 2008г.).- СПб. – 2008. – С. 94-97.
  5. Chiang S.J. Isolation of avian pneumovirus in QT-35cells//Chiand S.J., Dar A.M ,Goyal S.M. et al./ Vet. Rec. - 1998. - 143.- P. 596.
  6. Chette N.J., Turkey rhinotracheitis: detection of antibodies using an ELISA test / N.J. Chette, P.J. Wyeth // British Veterinary Journal. -1988.- 144, 282-287.
  7. Dulbecco R. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses //Dulbecco R., Vogt M.J./-J.exp.Med.-1954.-v.99.- no2. - pp. 167-182.
  8. Giraud P. Turkey rhinotracheitis in France preliminary investigations on a ciliostatic virus // P. Giraud, G. Beiwejean, M. Guittet et al.// Vet. Rec. - 1986. – V. 119. – P. 606-607.
  9. Goyal S.M. Isolation of avian pneumovirus from on outbreak of respiratory illness in Minnesota turkeys //Goyal S.M,Chiang S.J.,Dar A.M. et al./J. of Vet. Diagn. Invest.-2000.-12.-p.p. 166-168.
  10. Grant M. An enzyme - linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of turkey rhinotracheitis infection / M. Grant, C. Baxter-Jones, G.P. Wilding// Vet. Rec. – 1987. – V. 120. – P. 279 – 280.
  11. Patnayak D.P. Experimental and field evaluation of a live vaccine against avian pneumovirus //Patnayak D.P., Sheikh M.A., Gulati B.R. et al./Av. Pathol.-2002.-31.-p.p.377-382.
  12. Patnayak D.P. Gold adapted avian pnevmovirus for use as live, attenuated vaccine in turkeys //Patnayak D.P., Gulati B.R., Sheikh M.A., et al./ Vaccine. – 2003.-21.-p.p-1371-1374.
  13. Patnayak D.P.Growth of vaccine strains of avian pneumovirus in different cell lines. //Patnayak D.P, Tivari A., Goyal S.M./ Av. Path.-2005.-34(2).-p.p.123-126.
  14. Picault J.P. Isolation of a T.R.T.V.-live virus from chickens with swollen-head syndrome//Picault J.P., Giraud P., Drouin P. et al. / Vet. Rec.-1987.-121-p.135.
  15. Reed L.J. A simple method of estimating fifty percent endpoints //Reed L.J., Muench H./ Amer.J.of Hyg-1938.-V.27.-p.p.493-497.
  16. Wilding G.P. Ciliostatic agent found in rhinotracheitis//Wilding G.P., Jones C.S., Grant M./ Vet.Rec.-1986.-118.p.735.
  17. Youngner J.S. Monolayer tissue cultures: 1. Preparation and standartization of suspenstions of trypsin-dispersed monrey kidney cells //Youngner J.S./ Proc.Soc.Exp.Biol.a.Med(N.J.).-1954.-V.85.-no2.-p.202.

Тип информации: