Набор для диагностики синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) в РТГА

Набор предназначен для ретроспективной диагностики болезни по уровню гуморальных и желточных антител; оценки поствакцинального иммунитета; серологического контроля распространения возбудителя ССЯ-76 у птицепоголовья для ретроспективной диагностики болезни по уровню гуморальных и желточных антител; оценки поствакцинального иммунитета; серологического контроля распространения возбудителя ССЯ-76 у птицепоголовья .

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора для диагностики синдрома снижения яйценоскости-76 в реакции торможения гемагглютинации

I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Набор для диагностики синдрома снижения яйценоскости-76 в реакции торможения гемагглютинации. В состав набора входят:

• инактивированный антиген вируса синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76), лиофилизированный, объем 1,0 см3- 3 ампулы (флакона);
• гипериммунная сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 (положительный контроль), лиофилизированная, объем 1,0 см3 - 1 ампула (флакон);
• нормальная сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу ССЯ, лиофилизированная, объем 1,0 см3 -1 ампула (флакон).

Компоненты набора расфасованы в ампулы (стеклянные флаконы) соответствую­ щей вместимости, запаянные (укупорены резиновыми пробками) под вакуумом или инерт­ным газом. По внешнему виду компоненты набора представляют собой: инактивированный антиген вируса ССЯ-76 - сухая пористая масса белого или светло-жёлтого цвета; сыворотка крови нормальная и гипериммунная - сухая пористая масса бело-розового цвета. При добавлении физиологического раствора содержимое ампул (флаконов) с компо­нентами набора должно полностью раствориться в течение 1-3 мин. Каждая ампула (флакон) должна иметь этикетку с указанием: организации- производителя и ее товарного знака, наименования компонента, его объема, номера серии и контроля, даты изготовления (месяц, год), активности, срока годности, обозначения СТО. Этикетированные ампулы (флаконы) упаковывают в картонные коробки с наличием гнезд или перегородок, обеспечивающих целостность компонентов набора На коробке должна быть этикетка с указанием: организации-производителя и ее то­варного знака, наименования набора, перечня и количества компонентов, номера контроля и серии, даты изготовления (мес, год), срока годности, условий хранения, обозначения СТО. В каждую коробку вкладывают инструкцию по применению набора. Срок годности набора 18 мес с даты изготовления при хранении в сухом защищен­ ном от света месте и температуре от 4°С до 8°С. Набор по истечении срока годности к применению не пригоден. При нарушении целостности и укупорки ампул (флаконов), изменении цвета их со­держимого, наличии плесени и посторонних примесей, при низкой растворимости, при от­сутствии этикеток, а также в случае не использования в пределах срока годности, компонен­ты набора выбраковывают. Компоненты набора не токсичны. Утилизация наборов не требует специальных мер безопасности.

II. ПРИНЦИП РЕАКЦИИ

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на способности антител, содержащихся в сыворотки крови (экстрактах желтка), нейтрализовать гомологичный анти­ ген вируса ССЯ-76, что приводит к потере его агглютинирующей активности и визуально проявляется оседанием введенных в реакцию в качестве индикаторной системы куриных эритроцитов.

III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ

Набор предназначен для:

• ретроспективной диагностики синдрома снижения яйценоскости по уровню
• гумо­ральных и желточных антител;
• оценки эффективности иммунизации кур против данного заболевания;
• серологического контроля за распространением возбудителя ССЯ-76 в популяции сельскохозяйственных птиц.
•  

Для постановки ретроспективного диагноза на исследование доставляют парные пробы сыворотки крови (не менее 20-30 проб, объемом по 0,5-1,0 см3), отобранные с интервалом 14- 21 суток от партий птиц, подозреваемых в заболевании ССЯ-76, а также собранное от них не­ кондиционное (декальцинированное) яйцо в количестве 20-30 штук. Для оценки напряженности поствакцинального иммунитета на исследование направ­ляют 20-30 проб сыворотки крови объемом по 0,5-1,0 см3, отобранных через 4-7 недель после применения вакцины. Для серологического контроля за распространением возбудителя ССЯ-76 на ис­- следование направляют 20-30 проб сыворотки крови объемом по 0,5-1,0 см3, отобранных от не вакцинированных птиц. Для постановки РТГА используют:

• пипетки одно - и восьмиканальные автоматические фиксированного и переменного объёма до 0,02 см3, 0,2 см3 и 1,0 см со сменными наконечниками;
• посуду мерную лабораторную;
• термостат на (37,0±0,5)°С;
• полистироловые микро- или макропанели круглодонные для иммунологических ре­акций;
• физиологический раствор, рН 7,2-7,4;
• 1,0% взвесь эритроцитов петуха (кур) на физиологическом растворе с рН 7,2-7,4 (готовится общепринятым методом);

Подготовка проб для исследования. Испытуемые сыворотки крови до постановки реакции можно хранить при 4-8°С не более 3-х сут или в заморозке не ниже минус 20°С - 50-60 сут. Все пробы исследуют в РТГА одномоментно без дополнительной обработки. 15. Уровень желточных антител определяют в экстракте желтка. Для чего из каждого яй­ца отбирают по 1,5 см3 желтка и тщательно смешивают (суспендируют) с 6,0 см физиоло­гического раствора (рН 7,2-7,4) в пробирках соответствующего объема. В пробирки до­бавляют по 2,0 см3 дихлорэтилена и 1,0 см3 эфира для наркоза, закрывают резиновыми проб­ками и интенсивно встряхивают на шуттель-аппарате в течение 10-15 мин. Полученную смесь выдерживают в термостате при 37+0,5°С в течение 1 ч, периодически встряхивая. Затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочная жидкость является экстрактом желтка с исходным разведением 1:4 и ис­пользуется для постановки РТГА. Подготовка компонентов набора Содержимое ампул (флаконов) с антигеном, гипериммунной и нормальной сыво­ротками растворяют в 1,0 см3 физиологического раствора (рН 7,2 – 7,4). Допускается хранение восстановленного антигена в течение 48 ч при температуре 4-8°С, а контрольных сывороток - в течение одного месяца при температуре не выше минус 10°С. при этом последовательное замораживание-размораживание сывороток разрешается не более 3 раз. РТГА проводят в три этапа:

1. определение гемагглютинирующего титра антигена в реакции гемагглютинации (РГА);
2. подготовка рабочей дозы антигена;
3. выявление специфических антител в пробах сыворотки крови и/или в экстрактах желтка.

17.1. Постановка РГА. Для постановки РГА готовят двукратные разведения антигена от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки полистироловой микро- или макропанели разливают физиологический раствор (по 0,05 см3 - в каждую лунку микропанели или по 0,2 см3 - в каждую лунку в мак­ропанели). Затем, в первую лунку горизонтального ряда вносят равный объём подготовленного антигена вируса ССЯ-76, трёхкратно пипетируют и переносят по 0,05 см3 или 0,2 см3 во вто­рую лунку и т.д. Из последней лунки после трехкратного пипетирования 0,05 см3 или 0,2 см3 испытуемого материала удаляют в 2%-ый раствор едкого натрия или другой подобный де-зинфектант. После разведения антигена во все лунки вносят 1%-ную суспензию эритроцитов в объёме, равном исходному объёму физиологического раствора. Панели аккуратно встряхи­вают и оставляют при комнатной температуре (20-25°С) на 30 мин или при температуре 37°С-на20мин.. Для контроля эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации и определения времени учёта реакции в две-три лунки панели вносят двойной объем физиологического раствора (0,1 см3 или 0,4 см3) и добавляют по 0,05 см3 или 0,2 см3 1% суспензии эритроци­тов. Учёт реакции проводят после оседания эритроцитов в виде «пуговицы» в контрольных лунках. РГА оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде хорошо выраженно­го «зонтика», отрицательно - в виде «пуговки» при отсутствии спонтанной агглютинации их в контроле. За титр антигена принимают его наибольшее разведение, дающее чётко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде «зонтика», что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ).

Подготовка рабочей дозы антигена

Перед постановкой РТГА проверяют правильность выбранного рабочего разведения антигена вируса (4 ГАЕ), исходя из его титра, установленного в РГА (п. 16.1). Для этого исходный антиген разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получают от деления его титра на 4. Например: титр антигена в РГА 1:256. Следова­тельно, для приготовления рабочего разведения антигена необходимо взять 63,0 см физио­логического раствора и 1,0 см3 исходного антигена (256:4=64). Объём рабочей дозы антигена определяют, исходя из количества подлежащих иссле­дованию сывороток. На исследование в РТГА одной пробы сыворотки/экстракта желтка в 12 разведениях при постановки реакции микрометодом требуется 0,6 см3, при постановке мак­рометодом - 2,4 см3 4 ГАЕ антигена. Рабочую дозу антигена готовят непосредственно в день постановки реакции с обяза­тельным контролем 4 ГАЕ. Для этого в пять лунок вносят физиологический раствор в объёме, выбранном для по­становки реакции. В первую и вторую лунку добавляют равный объём рабочей дозы антиге­на и титруют согласно п. 16.1, начиная со второй лунки. Для определения времени учёта реакции в две-три лунки панели с двойным объёмом физиологического раствора добавляют по 0,05 см3 или 0,2 см31,0 % суспензии эритроцитов.

Учёт реакции

Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле. При правильном оп­ределении рабочей дозы антигена в первой, второй и третьей лунках, где соответственно со­держатся 4,2 и 1 ГАЕ, должна быть полная агглютинация эритроцитов («зонтик»), в четвер­той и в пятой - ее отсутствие («пуговка»). Допускается частичная агглютинация эритроцитов в четвертой лунке, содержащей ½ ГАЕ антигена. Полная агглютинация в четвертой лунке означает, что доза антигена завышена, а от­сутствие агглютинации в первой-третьей лунках свидетельствует о недостаточном его коли­честве. Корректирование рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят путём добав­ления антигена или физиологического раствора с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ. Выявление специфических антител в пробах сыворотки крови и/или в экстрак-­ тах желтка. Во все лунки полистироловой панели разливают физиологический раствор в объёме 0,05 см или 0,2 см . Затем в первые лунки каждого горизонтального ряда вносят равный объём испытуемой сыворотки или экстракта желтка и путем трехкратного пипетирования подготавливают ряд последовательных двукратных разведений (с 1:2 до 1:4096). После этого, во все лунки вносят рабочее разведение антигена в выбранном объёме (0,05 см или 0,2 см ), затем осторожно встряхивают для равномерного перемешивания и после контакта при комнатной температуре (20-25°С) в течение 30 мин или при температуре 37° С- в течение 20 мин в каждую лунку добавляют двойной объем (по отношению к объему физиологического раствора) 1% суспензии эритроцитов. Реакция проходит при комнатной температуре (20-25°С) в течение 30 мин или при температуре 37°С- на 20 мин. (до оседания эритроцитов в контрольных лунках).

Одновременно ставят контроли реакции:

на отсутствие изоагглютинации сывороток или экстракта желтка - в одну лунку по­ листироловой панели внести 0,05 см3 или 0,2 см3 физиологического раствора, добавляют равный объём испытуемой сыворотки или экстракта желтка и 1%-ной суспензии эритроци-­ тов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать. на спонтанную агглютинацию эритроцитов - 0,05 см3 или 0,2 см3 1%-ной суспензии эритроцитов добавить к двойному объёму физиологического раствора. Спонтанная агглюти-­ нация эритроцитов должна отсутствовать. контроль специфичности антигена - в лунки полистироловой панели внести по 0,05 см3 или 0,2 см3 физиологического раствора. Затем в первые лунки добавляют равные объе-­ мы гипериммунной и нормальной сыворотки, трижды пипетируют и подготавливают после-­ довательные двукратные разведения с 1:2-1:4096. После этого в лунки вносят рабочую дозу антигена в выбранном объеме, осторожно встряхивают и оставляют для контакта при ком-­ натной температуре (20-25°С) на 30 мин или при 37°С - на 20 мин. После этого, в каждую лунку добавляют двойной объем (по отношению к объему физиологического раствора) 1% суспензии эритроцитов. Гипериммунная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность 4 ГАЕ антигена в титре, указанном на этикетке ампулы(флакона) с положительной сывороткой ± одно разведение, что подтверждает принадлежность антигена к вирусу ССЯ-76 и дополни­тельно подтверждает правильность подготовки рабочей дозы антигена. Положительная ре­акция с нормальной сывороткой должна отсутствовать.

Учёт результатов реакции

Учёт результатов реакции проводят визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде «пуговки») при отсутствии спонтанной агглютинации эритроци­тов и изоагглютинации сыворотки/экстракта желтка. Титром антител в сыворотке крови/экстракте желтка считают наибольшее разведение образца, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов антигеном вируса ССЯ-76. При правильном выполнении методики исследования специфические титры антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови и в экстрактах желтка не должны отличаться более чем на одно разведение.

Интерпретация полученных результатов

Ретроспективный диагноз ССЯ-76. Обнаружение не менее,4-кратного прироста специфических антител в 50 и более процен­тах парных проб сыворотки крови/экстрактах желтка, отобранных с интервалом 14-21 суток от птиц, подозреваемых в заболевании ССЯ-76, дает основание для постановки диагноза на дан­ное заболевание. Если прирост титра антител в исследованных пробах не достиг 4-кратного прироста или он выявлен менее чем в 50 процентах случаев, хозяйство считается условно неблагопо­лучным и в лабораторию направляют удвоенное количество проб сыворотки крови и яиц от птиц, подозреваемых в заболевании ССЯ-76, для повторного исследования. Получение аналогичных результатов при повторном исследовании материалов основа­нием для постановки положительного диагноза на ССЯ-76 не является.

Оценка поствакцинального иммунитета.

По результатам РТГА определяют эффективность иммунизации партии привитых кур путём деления суммарного количества проб с титром антител 1:32 и выше на общее число исследованных сывороток и выражают в процентах. Птицу считают иммунной к вирусу ССЯ-76 при эффективности иммунизации 80 и более процентов. При получении неудовлетворительных результатов проводят повторные серологические исследования через 10-14 дней и делают окончательное заключение об эффективности проведен­ной иммунизации. Серологический контроль за распространением возбудителя ССЯ-76. Обнаружение специфических антител в исследуемых пробах сыворотки кро­ви/экстракте желтка в титре 1:16 и выше в хозяйствах, где не проводится специфиче­ская профилактика ССЯ-76, свидетельствует о циркуляции полевого возбудителя ССЯ-76 и неблагополучии птицехозяйства по данному заболеванию.

IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

При работе с набором следует избегать нарушения целостности стеклянных ампул (флаконов), в которые расфасованы компоненты набора. При нарушении целостности ампул (флаконов) и порезах рук стеклом, первую по­мощь оказывают согласно общепринятым методикам. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора. Набор следует хранить в местах, не доступных для детей.