Набор для выявления антител к вирусу энтерита в сыворотках крови гусей в ИФА (Диагностикум ВЭГ)

Вирусный энтерит гусей (ВЭГ) - острая высококонтагиозная болезнь гусей и муксусных уток, характеризующаяся поражением желудочно-кишечного тракта, печени и высокой летальностью. В естественных условиях болеют гусята и муксусные утята в возрасте от 1 до 30 дней. Заражение в основном происходит алиментарным и аэрогенным путем, возможна трансовариальная передача вируса. Переболевшая птица может оставаться вирусоносителем в течение нескольких лет. Болезнь широко распространена в мире и вызывает гибель 30—90% заболевших гусят. У реконвалесцентов ВН-антитела обнаруживали в течение 80 мес. В желтке яиц, снесенных гусями через 68—72 мес. после переболевания, также обнаружены антитела. Вылупившиеся из них гусята в течение двух недель оставались резистентными к заражению вирулентным штаммом вируса.

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора для выявления антител к вирусу энтерита в сыворотках крови гусей иммуноферментным методом.

(Организация – производитель: ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии г. С-Петербург, Ломоносов)

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

1. Набор для выявления антител к вирусу энтерита в сыворотках крови гусей иммуноферментным методом. 2. В состав набора входят иммуноспецифические и неспецифические компоненты:

Иммуноспецифические компоненты:

К.1 – положительная сыворотка крови гусей, содержащая антитела к вирусу энтерита гусей (положительный контроль), лиофилизированная, объем 1,0 см³ – 1 ампула (флакон); К.2 – нормальная сыворотка крови гусей, не содержащая антител к вирусу энтерита гусей (отрицательный контроль), лиофилизированная, объем 1,0 см³ - 1 ампула (флакон); К.3 – полистироловые 96-луночные планшеты с адсорбированным в лунках очищенным инактивированным антигеном вируса энтерита гусей (ВЭГ) – 2 шт.; К.4 – антивидовой (кроличий) иммунопероксидазный конъюгат против IgG гусей, лиофилизированный, объем 0,2 см³ – 1 ампула (флакон);

Неспецифические компоненты:

К.5–буферный раствор (концентрированный) для разведения контрольных и испытуемых сывороток, антивидового конъюгата и межэтапных промывок, объем 5,0 см³ – 1 флакон; К.6 – набор солей для приготовления фосфатно- цитратного буферного раствора, таблетка, 0,63 г, - 2 шт.; К.7 – детергент твин-20, объем 5,0 см³ – 1 флакон; К.8 – субстрат – ортофенилендиамин (ОФД), таблетка, 5 мг , 2 шт.; К.9 – гидроперит, таблетка, 1,5 г –1 шт.; К.10 – натрий хлористый, кристаллический порошок, 22,0 г – 1флакон. 3. Иммуноспецифические компоненты расфасованы в стеклянные ампулы (флаконы). Ампулы запаивают, а флаконы укупоривают пробками, укрепленными алюминевыми колпачками. По внешнему виду иммуноспецифические компоненты представляют собой:

  • сыворотки -сухую пористую массу белого цвета;
  • антивидовой иммунопероксидазный конъюгат- сухую пористую массу белого или кремового цвета;

При добавлении буферного раствора содержимое флаконов с лиофилизированными компонентами должно полностью раствориться в течение 1-3 мин. Неспецифические компоненты расфасованы в стеклянные флаконы, укупоренные резиновыми пробками,укрепленными алюминевыми колпачками. По внешнему виду неспецифические компоненты представляют собой:

  • буферный раствор (концентрированный) для разведения контрольных и испытуемых сывороток, антивидового конъюгата и межэтапных промывок - прозрачную бесцветную жидкость;
  • набор солей для приготовления фосфатно-цитратного буферного раствора - таблетку белого цвета;
  • субстрат-ортофенилендиамин (ОФД) - таблетку белого или кремового цвета;
  • детергент твин-20 - прозрачную жидкость светло-желтого цвета;
  • натрий хлористый- порошок белого цвета;
  • гидроперит - таблетку белого цвета.

Планшеты запаяны в пакет из полиэтилена, в который вложен влагопоглотитель. На упаковке с планшетами должна быть этикетка с указанием: наименование организации- производителя и ее товарного знака, наименования антигена, адсорбированного в лунках планшета, номера серии и контроля, срока годности. 4. На ампулы (флаконы) с компонентами набора наклеивают этикетки с указанием: наименование организации-производителя и ее товарного знака, название и номер компонента, объема/массы в ампуле (флаконе), номера серии и контроля, рабочего разведения компонента (для антивидового конъюгата), даты изготовления, срока годности. Ампулы (флаконы) с компонентами и планшеты упаковывают в картонные коробки с наличием гнезд и перегородок, обеспечивающих их целостность и неподвижность. На коробку с набором наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование организации- производителя, ее адрес и товарный знак, название набора, перечень и количество компонента, номер серии и контроля, дату изготовления набора (месяц, год), срок годности, условия хранения, обозначение СТО, знак соответствия, регистрационный номер, штрих-код и надпись «Для животных». В каждую коробку вкладывают инструкцию по применению набора. Набор рассчитан на исследование 176 проб сывороток крови гусей при исследовании в одном разведении 1:400 и на 20 проб - при раститровке сывороток двукратным шагом от 1:100 до 1:12800. Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких исследований по мере поступления биологического материала. 5. Срок годности набора 12 мес. со дня изготовления при хранении и транспортировании в сухом защищенном от света месте при температуре 4-8ºС. Замораживание компонентов набора не допускается! Запрещено смешивать компоненты наборов разных серий и использовать набор по истечении срока годности. 6. При нарушении целостности и укупорки ампул (флаконов), упаковки планшетов, изменении цвета содержимого, наличии плесени и посторонних примесей, при низкой растворимости, при отсутствии этикеток, а также в случае не использования в пределах срока годности набор выбраковывают, а иммуноспецифические компоненты обеззараживают кипячением в течение 15 мин. Неиспользованные планшеты дезинфицируют в 3% растворе щелочи.

II. ПРИНЦИП РЕАКЦИИ

7. Сущность непрямого варианта метода иммуноферментного анализа заключается в выявлении комплекса, образованного антигеном, сорбированным в лунках полистироливого планшета и специфическими антителами, содержащимися в пробах сывороток крови гусей. Специфический комплекс выявляется антивидовыми IgG, ковалентно связанными с ферментом – пероксидазой хрена, который при взаимодействии с субстратом (Н2О2) в составе хромогенной смеси (ОФД) вызывает ее окрашивание. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе.

III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ

8. Набор предназначен для:

  • серологического контроля за распространением ВЭГ в популяциях гусей;
  • оценки эффективности иммунизации поголовья против данного заболевания;
  • ретроспективной диагностики ВЭГ у гусей по приросту уровня специфических антител.

Для исследования из гусеводческих хозяйств в лабораторию доставляют не менее 25 проб (по 0,2-0,3 см3) сыворотки крови гусей без признаков гемолиза и бактериальной контаминации. До постановки ИФА сыворотки можно хранить в морозильной камере бытового холодильникана (минус 20ºС) в течение 50-60 суток, при температуре 4ºС - более 3-х суток.

Для постановки ИФА используют:

  • пипетки одно- и восьмиканальные автоматические переменного объема до 0,02 см³ , до 0,2 см³ и до 1,0 см³ со сменными наконечниками;
  • посуду мерную лабораторную;
  • пробирки для разведения проб;
  • дистиллированную или деионизованную воду (рН= 6,0-6,2);
  • термостат с поддержанием температуры (37,0±0,5)ºС;
  • холодильник бытовой;
  • рН-метр;
  • спектрофотометр (ридер) с вертикальным лучом при длине волны 492 нм;

Следует помнить, что ИФА является высокочувствительным методом, поэтому ошибки связанные с подготовкой образцов, проведением инкубационного, температурного и промывочного режимов могут быть причиной получения недостоверных результатов. Перед началом работы набор с компонентами выдерживают 30 минут при температуре 18-20ºС. Остатки неиспользованных реагентов убирают в холодильник (4-8ºС) сразу же после проведения исследования. 9. Подготовка рабочих растворов 9.1 Раствор № 1 - буферный раствор для разведения контрольных и испытуемых сывороток, антивидового конъюгата и межэтапных промывок. Содержимое флаконов К.5 и К.10 растворить в 750,0 см³ дистиллированной воды и измерить величину рН, которая должна быть в пределах 7,0-7,4. Затем в этот раствор добавить содержимое флакона К.7. Раствор рекомендуется хранить при температуре 4-8ºС не более 15 суток. 9.2 Раствор № 2 - фосфатно-цитратный буферный раствор. Содержимое флакона К.6 (1 таблетку) растворить в 10,0 см³ дистиллированной воды. Полученный раствор должен иметь рН в пределах 4,9-5,0. Готовить перед использованием. 9.3 Раствор № 3. 1 таблетку гидроперита (К.9) растворить в 45,0 см³ дистиллированной воды. Раствор хранить в защищенном от света месте при температуре 4-8оС не более 10 сут. 9.4 Раствор № 4 - субстратно-индикаторная смесь. 1 таблетку ОФД (К.8) растворить в 10,0 см³ раствора № 2, перемешать до полного растворения и добавить 0,4 см³ раствора № 3. Раствор № 4 готовить непосредственно перед использованием. Хранению не подлежит. 9.5 Раствор № 5 - стоп - раствор. 1,0 см³ концентрированной серной кислоты (в наборе отсутствует) растворить в 10,0 см³ дистиллированной воды. Раствор рекомендуется хранить во флаконе из темного стекла при температуре 18-25оС не более одного месяца. В связи с высокой токсичностью ОФД и серной кислоты приготовление субстратно-индикаторной смеси и стоп-раствора проводить в резиновых перчатках, избегая попадания на кожу и слизистые оболочки.

10. Подготовка иммуноспецифических компонентов.

10.1 К содержимому ампулы (флакона) с лиофилизированной положительной сывороткой крови гусей (К.1) добавить 1,0 см³ раствора № 1. Готовят перед использованием. Подготовленную сыворотку рекомендуется хранить при температуре минус 10ºС и ниже не более 15 сут. В течение срока годности размораживание допускается один раз. 10.2 К содержимому ампулы (флакона) с лиофилизированной нормальной сывороткой крови гусей (К.2) добавить 1,0 см³ раствора № 1. Готовят перед использованием. Подготовленную сыворотку рекомендуется хранить при температуре минус 10ºС и ниже не более 15 сут. В течение срока годности размораживание допускается один раз.

10.3 Рабочий раствор конъюгата

К содержимому ампулы (флакона) с антивидовым конъюгатом (К.4) добавить 21,0 см³ раствора № 1. Раствор конъюгата рекомендуется хранить при температуре минус 10ºС и ниже не более 15 сут. В течение срока годности размораживание допускается один раз. 10.4. Разведение испытуемых и контрольных сывороток крови. 10.4.1 При постановке ИФА в одном разведении все испытуемые и контрольные сыворотки (положительную и нормальную) развести 1:400 раствором №1. Для контрольных к 0,3 см3 раствора №1 добавить 0,1 см3 сыворотки крови гусей, для испытуемых к 1,0 см3 раствора №1 добавить 0,0025 см3 сыворотки крови гусей и трижды пипетировать, используя для каждой пробы новый наконечник. 10.4.2 При постановке ИФА методом раститровки контрольные пробы сывороток (положительная и нормальная), приготовленные по п.п. 10.1 и 10.2, разведены 1:100. Готовы к использованию. Все испытуемые пробы сывороток крови гусей развести 1:100 раствором №1. Для чего к 1,0 см3 раствора №1 добавить 0,01 см3 сыворотки крови и трижды пипетировать, используя для каждой пробы новый наконечник.

11. Постановка реакции

Из комплекта набора взять планшет (К.3), сенсибилизированный антигеном ВЭГ. 11.1 При постановке ИФА в одном разведении в лунки вертикальных рядов планшета А1,В1,С1 внести положительную сыворотку, подготовленную по п.10.4.1 в объеме 0,1 см3. В лунки планшета D1,E1,F1 внести нормальную сыворотку (отрицательный контроль), подготовленную по п. 10.4.1 в объеме 0,1 см3. Лунки G1-H1 служат контролем конъюгата и заполняются раствором №1 по 0,1 см3. В остальные лунки планшета внести испытуемые пробы, подготовленные по п. 10.4.1 в объеме 0,1 см3. 11.1.2. Планшет осторожно встряхнуть для перемешивания содержимого, накрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре 37± 0,5ºС в течение 30 мин. По окончании инкубации лунки планшета освободить от содержимого резким встряхиванием и трехкратно промыть раствором № 1(по 0,3 см³ в каждую лунку). Затем жидкость окончательно удалить и планшет подсушить, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. 11.1.3. Во все используемые лунки планшета внести по 0,1 см³ рабочего раствора конъюгата, накрыть крышкой и инкубировать 30 минут при температуре 37± 0,5ºС. По окончании инкубации лунки планшета освободить от содержимого резким встряхиванием и трехкратно промыть раствором № 1(по 0,3 см3 в каждую лунку). Затем жидкость окончательно удалить и планшет подсушить, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. 11.1.4. Во все используемые лунки планшета внести по 0,1 см³ раствора №4, накрыть крышкой и выдержать 3-5 мин при температуре 18-25ºС в темном месте. 11.1.5. Реакцию остановить добавлением в каждую используемую лунку по 0,05 см³(50 мкл) раствора №5. 11.2. При постановке ИФА методом раститровки во все лунки рядов планшета В1-В12…Н1-Н12 внести по 0,1 см3 раствора №1. В лунку планшета А1 внести нормальную сыворотку (отрицательный контроль), подготовленную по п.10.4.2 в объеме 0,2 см3. В лунку планшета А2 внести положительную сыворотку, подготовленную по п. 10.4.2 в объеме 0,2 см3. В остальные лунки планшета А3-А12 внести испытуемые пробы, подготовленные по п. 10.4.2 в объеме 0,2 см3. Провести раститровку по вертикальным рядам А1-Н1…А12-Н12 с разведения 1:100 до 1:12800, перенося 0,1 см3 в очередную лунку вертикального ряда. Из последних лунок Н1-Н12 удалить по 0,1 см3. Дальнейшую постановку ИФА проводят аналогично по п. 11.1.2 – 11.1.5. 12. После остановки реакции учет результатов ИФА проводят визуально – по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально – с помощью спектрофотометра (ридера) с вертикальным лучом света при длине волны 492 нм. 12.1 При визуальном способе учета первоначально оценивают контрольные лунки: положительный контроль (положительная сыворотка) при раститровке окрашивается в желтый цвет различной интенсивности, отрицательный контроль (нормальная сыворотка) остается неокрашенным или незначительно желтеет. 12.1.2 Затем сравнивают окраску содержимого лунок планшета испытуемых проб с окраской лунок отрицательного контроля. Титром испытуемой сыворотки считается ее предельное разведение, при котором наблюдают видимое глазом цветовое окрашивание, более интенсивное по сравнению с отрицательным контролем. Титр контрольной положительной сыворотки должен быть не менее 1:800. 12.2 Инструментальный спектрофотометрический способ учета результатов может быть использован как при постановке ИФА в одном разведении, так и при раститровке сыворотки крови. Он позволяет количественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности (ОП 492 нм). При правильной постановке ИФА и использовании качественных компонентов набора среднее значение ОП отрицательного контроля в разведении 1:400 не должно превышать 0,200. Разница показателей средних значений оптических плотностей положительного и отрицательного контролей в разведении 1:400 должна быть в диапазоне 0,340-0,980. Если полученные данные выходят за пределы этих значений, результаты считаются недостоверными и реакцию повторяют.

Расчет S/P-отношения:

Полученные значения S/P позволяют дифференцировать испытуемые сыворотки на положительные, отрицательные и сомнительные. Пробы сывороток крови со значениями S/P ниже или равными 0,2 считаются отрицательными, 0,21 - 0,23 – сомнительными, больше или равными 0,24 – положительными. Расчет титра сыворотки по одному разведению (1:400) проводят по формуле: Lg TИТР = 1,41 (lg S/P) + 3,56 Пример:

Отношение S/P =0,22
Lg ТИТР = 1,41(lg 0,22)+3,56
Lg ТИТР = 1,41 (-0,658) + 3,56
Lg ТИТР = 2,63
ТИТР = Antilog 2,63
ТИТР = 427

При постановке ИФА методом раститровки титром испытуемой сыворотки считается последнее ее разведение, в котором оптическая плотность превышает таковую отрицательного контроля в 2,0-2,1 раза. При постановке ИФА в одном разведении (инструментальном методе учета) пробы сывороток крови, содержащие антитела в титре 1:400 и ниже считаются отрицательными, 1:401-1:499 – сомнительными, а 1:500 и выше – положительными. 13. Интерпретация результатов По результатам ИФА определяют напряженность иммунитета в партии привитых гусей путем деления количества положительных проб на общее количество исследованных сывороток и выражают в процентах. Птицу считают иммунной к вирусному энтериту гусей (ВЭГ) при напряженности иммунитета 80 и более процентов (т.е. если в 80 и более процентах исследованных проб сывороток крови титр антител 1:800 и выше). Обнаружение антител у невакцинированной птицы свидетельствует о возможной циркуляции в стаде полевого вируса ВЭГ. В таких случаях через 21-30 суток проводят повторное исследование проб сывороток крови, полученных от этих же птиц. Нарастание титров и (или) увеличение количества птиц с высоким уровнем антител при отсутствии клинических и патологоанатомических признаков ВЭГ не является основанием для объявления в хозяйстве неблагополучия по данному заболеванию, но предусматривает установления за птицей тщательного наблюдения, проведения систематических серологических и вирусологических исследований.

IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

14. При работе с набором следует избегать нарушения целостности стеклянных ампул (флаконов) с компонентами набора. 15. При нарушении целостности флаконов и порезах рук стеклом первую помощь оказывают согласно общепринятым методикам. 16. Работу с химическими компонентами набора следует проводить очень осторожно. При попадании их на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промывать пораженное место большим количеством водопроводной воды. 17. В связи с высокой токсичностью ОФД и серной кислоты приготовление субстратно-индикаторной смеси и стоп-раствора проводить в резиновых перчатках, избегая попадания на кожу и слизистые оболочки. 18. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора. 19. Препарат следует хранить в местах недоступных для детей.

Продукция: